میکروسکوپ الکترونی | میکروسکوپ الکترونی چگونه کار می‌کند؟

میکروسکوپ الکترونی چیست؟

دسته‌ای از میکروسکوپ‌ها که از پرتویی از الکترون‌های شتاب‌دار به عنوان منبع تابش استفاده می‌کنند، میکروسکوپ‌های الکترونی نامیده می‌شوند. تصویر‌برداری با استفاده از میکروسکوپ الکترونی (Electron Microscope)، تکنیکی برای به‌دست آوردن تصاویر با وضوح بالا از نمونه‌های بیولوژیکی و غیر بیولوژیکی است. میکروسکوپ الکترونی در تحقیقات زیست پزشکی برای بررسی ساختار دقیق بافت‌ها، سلول‌ها، اندامک‌ها و مجتمع‌های ماکرومولکولی استفاده می‌شود.

The Principle of the Electron Microscope

وضوح بالای تصاویر میکروسکوپ‌های الکترونی همراه با بزرگنمایی تا حد یک میلیون برابر، ناشی از استفاده الکترون به عنوان منبع تابش است. با توجه به اینکه طول موج پرتوی الکترون ۱۰۰ هزار مرتبه کوچک‌تر از طول موج فوتون‌های نور مرئی است، میکروسکوپ‌های الکترونی دارای قدرت آشکار‌سازی به مراتب بیشتر از میکروسکوپ‌های نوری یا اپتیکی هستند. این میکروسکوپ‌ها می‌توانند با قدرت تفکیک بهتر از ۵۰ پیکومتر، تصویر ساختاری از ریزترین اجسام را ارائه دهند.

بزرگنمایی میکروسکوپ‌های الکترونی بیش از ۱۰ میلیون برابر است، در حالی که میکروسکوپ‌های نوری به علت محدودیت حاصل از پدیده پراش دارای رزولوشن ۲۰۰ نانومتر و بزرگنمایی کمتر از ۲۰۰۰ برابر هستند.

در شرایط عادی و نور کافی و بدون استفاده از لنزهای بزرگنمایی، چشم انسان قادر به تفکیک دو جسم در فاصله حداقل ۰.۲ میلیمتر از یکدیگر می‌باشد که به این فاصله رزولوشن چشم می‌گویند. لنزهای بزرگنمایی و ادوات همراه آن‌ها که میکروسکوپ نامیده می‌شوند، کمک می‌کنند تا این فاصله بزرگنمایی شود و انسان بتواند اجسامی با فصله کمتر از ۰.۲ میلیمتر نسبت به یکدیگر را نیز از یکدیگر تمییز دهد.

از آنجا که ابعاد افزاره‌ها، سیستم‌ها و مواد گوناگون در حال کوچک‌تر شدن است، ساختار بسیاری از مواد با میکروسکوپ‌های نوری قابل تشخیص و بررسی نیست. مثلا به منظور تعیین یکپارچگی یک لایه نانو الیاف با کاربرد فیلتراسیون، نیاز است تا از میکروسکوپ الکترونی کمک گرفته شود.

تاریخچه اختراع میکروسکوپ الکترونی

اولین نمونه میکروسکوپ الکترونی برای اولین بار در سال ۱۹۳۱ توسط ارنست روسکا و ماکس نول در دانشگاه صنعتی برلین تولید شد. این دستگاه قادر به بزرگنمایی ۴۰۰ برابری تصاویر اجسام بود. سپس شرکت زیمنس، با سرمایه‌گذاری بر کار ارنست روسکا و بودو ون بوریس، کاربردهای میکروسکوپ الکترونی را، به ویژه در زمینه مشاهده نمونه‌های زیستی، ارتقاء داد و اولین میکروسکوپ الکترونی تجاری را در سال ۱۹۳۸ تولید کرد.

میکروسکوپ‌های الکترونی عبوری کنونی، همچنان بر اساس نمونه ساخته شده توسط روسکا کار می‌کنند، با این تفاوت که بزرگنمایی آنها اکنون به دو میلیون برابر رسیده است.

بخش‌های مختلف میکروسکوپ الکترونی

اجزای میکروسکوپ الکترونی دارای چند بخش اصلی هستند:

• تفنگ الکترونی که به روش‌های مختلف الکترون تولید می‌نماید و پرتو الکترونی فرودی بر سطح نمونه را تامین می‌کند.
• لنزهای الکترومغناطیسی که به متمرکز کردن پرتو الکترونی بر روی نمونه و بزرگنمایی تصویر کمک می‌کنند.
• نگهدارنده نمونه که نمونه را ثابت نگاه می دارد.
• سیستم تصویربرداری برای ایجاد تصویر نهایی

میکروسکوپ الکترونی چگونه کار می‌کند؟

هنگاهی که پرتوی پر انرژی الکترونی به سطح نمونه برخورد می‌کند، واکنش‌های مختلفی ممکن است رخ دهد. بخشی از الکترون‌ها با اتم‌های نمونه برخورد کرده و با تغییر جهت ۱۸۰ درجه‌ای در مسیر مخالف باز می‌گردند. به این دسته از الکترون‌ها، الکترون‌های بازگشتی (Backscattered Electron) می‌گویند. تعداد دیگری از الکترون‌ها از نزدیکی اتم‌ها عبور می‌کنند. مسیر عبوری آن‌ها آنقدر نزدیک به اتم‌های نمونه است که بخشی از انرژی خود را به الکترون‌های اتم منتقل می‌کنند. در اثر این انتقال انرژی، الکترون فرودی، مقداری از انرژی خود را از دست داده و تغییر مسیر می‌دهد و اتم مورد نظر نیز الکترون خود را از دست می‌دهد و یونیزه می‌شود.

الکترون جدا شده از اتم که با انرژی بسیار کم (در حدود ۵۰ الکترون ولت) اتم را ترک می‌کند، الکترون ثانویه (Secondary Electron) نامیده می‌شود. هر کدام از الکترون‌های فرودی می‌توانند چندین الکترون ثانویه ایجاد کنند. جای خالی ایجاد شده در اتم به علت جدا شدن الکترون ثانویه، توسط یک الکترون از ترازهای بالاتر پر می‌شود. فرود الکترون به لایه‌ای با انرژی کمتر، موجب ایجاد انرژی مازاد در اتم می‌شود. این انرژی مازاد با جدا شدن یک الکترون از خارجی‌ترین لایه اتم یا ساطع شدن اشعه ایکس از اتم جبران می‌شود. به این الکترون جدا شده الکترون اوژه (Auger Electron) می‌گویند (شکل ۱).

در صورتی که ضخامت نمونه به اندازه کافی کم باشد، دسته‌ای از الکترون‌ها از آن عبور می‌کنند بدون آنکه واکنش و برخوردی انجام دهند. به این دسته از الکترون‌ها، الکترون‌های غیر برگشتی (Unscattered Electron) می‌گویند. دسته‌ای از الکترون‌ها نیز پس از برخورد با اتم به صورت الاستیک منحرف می‌شوند. یعنی بدون از دست دادن انرژی خود در مسیر دیگری از نمونه عبور می‌کنند. الکترون‌هایی که به صورت غیر الاستیک با اتم برخورد می‌کنند نیز مقداری از انرژی خود را از دست داده و از سایر بخش‌های نمونه عبور می‌کنند.

انواع میکروسکوپ الکترونی

میکروسکوپ های الکترونی انواع مختلفی دارند که در اینجا، به انواع میکروسکوپ‌های الکترونی اشاره شده است:

• میکروسکوپ الکترونی عبوری یا Transmission Electron Microscope) TEM)
• میکروسکوپ الکترونی روبشی یا Scanning Electron Microscope) SEM)
  • میکروسکوپ الکترونی روبشی گسیل میدانی یا FESEM
• میکروسکوپ الکترونی انعکاسی یا Reflection Electron Microscopy) REM)
• میکروسکوپ تونلی روبشی یا Scanning Tunneling Microscopy) STM)

میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)

از میکروسکوپ الکترونی عبوری برای مشاهده نمونه‌های نازک (بخش‌های بافتی، مولکول‌ها و غیره) استفاده می‌شود که الکترون‌ها از آنها عبور می‌کنند و تصویر تولید می‌کنند.

TEM، از بسیاری جهات شبیه به میکروسکوپ نوری معمولی (مرکب) است. از TEM برای تصویربرداری از فضای داخل سلول‌ها (در بخش‌های نازک)، ساختار مولکول‌های پروتئین (با استفاده از تکنیک Metal Shadowing)، ساختار مولکول‌ها ‌در ویروس‌ها و رشته‌های اسکلتی، و آرایش مولکول‌های پروتئین در غشای سلول استفاده می‌شود.

میکروسکوپ الکترونی عبوری چگونه کار می‌کند؟

Transmission Electron Microscope Operating Principle

این میکروسکوپ الکترونی در دو حالت اصلی استفاده می‌شود: حالت تصویربرداری و حالت پراش. در حالت اول، تصویری از نمونه ایجاد می‌شود، در صورتی که حالت دوم ابزاری قدرتمند برای بازسازی سلول‌ها و تشخیص جهات کریستالی است.

نمونه TEM معمولا یک تکه خیلی نازک از نمونه با ضخامت کمتر از ۱۰۰ نانومتر، معلق بر روی یک توری به قطر استاندارد ۳.۰۵ میلیمتر و ضخامت و اندازه مش چند میکرون تا ۱۰۰ میکرون، ساخته شده از مس، مولیبدن، طلا یا پلاتین است.

میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)

میکروسکوپ الکترونی روبشی بر اساس گسیل الکترون‌های ثانویه عمل می‌کند. از آنجا که الکترون‌های ثانویه انرژی کمی دارند، دارای میانگین مسیر آزاد (Mean Free Path) کمی در اجسام جامد هستند و در سطح جسم تا عمق چند نانومتر حرکت می‌کنند. تصویری که در اثر الکترون‌های ثانویه ایجاد می‌شود از سطح جسم با رزولوشنی کمتر از ۱ نانومتر است. این در حالی است که تصویر ناشی از الکترون‌های بازگشتی، به علت انرژی بیشتر آن‌ها عمیق‌تر بوده و رزولوشن کمتری نیز دارد.

نحوه کار با میکروسکوپ الکترونی روبشی 

Scanning Electron Microscope Operating Principle

میکروسکوپ الکترونی روبشی گسیل میدانی (FESEM)

میکروسکوپ الکترونی روبشی گسیل میدانی (FESEM) دارای تفنگ الکترونی پیشرفته‌تری نسبت به SEM است و در صورتی که روش SEM قادر به تصویربرداری دقیق از سطح نمونه نباشد از این روش استفاده می‌شود. در FESEM الکترون‌ها از طریق یک کاتد گسیل میدانی تولید می‌شوند که دارای پرتو روبشی باریک‌تر و الکترون‌های با انرژی بیشتری است. در نتیجه امکان تهیۀ تصاویر شفاف‌تر و دارای اعوجاج الکترواستاتیکی کمتر را فراهم می‌کند و رزولوشن فضایی را تا ۱.۵ نانومتر افزایش می‌دهد. همچنین در این روش احتمال تجمع بار بر روی سطح نمونه و آسیب به آن را کاهش می‌یابد.

میکروسکوپ الکترونی انعکاسی (REM)

در میکروسکوپ الکترونی انعکاسی (REM) مانند روش‌های قبل، یک پرتو الکترونی بر روی سطح نمونه برخورد می‌کند، اما به جای استفاده از الکترون‌های عبوری (TEM) یا الکترون‌های ثانویه (SEM)، پرتو منعکس شده از الکترون‌های پراکنده شده یه صورت کشسان برای تصویر‌برداری استفاده می‌شوند. این روش معمولا در ترکیب با روش‌های مشخصه‌یابی دیگر مانند پراش بازتابش الکترون‌های پر‌انرژی (RHEED)، طیف سنجی اتلاف انرژی الکترون‌های پر‌انرژی بازتابیده (RHELS) و میکروسکوپ الکترون‌های کم‌انرژی با قطبش اسپینی (SPLEEM)، برای مطالعه میکروساختار حوز‌ه‌های مغناطیسی، استفاده می‌شود.

میکروسکوپ الکترونی تونلی (STM)

روش STM با استفاده از فرضیۀ تونل‌زنی کوانتومی برای تصویربرداری از سطوح در مقیاس اتمی استفاده می‌شود. در روش STM  یک سوزن بسیار رسانا در فاصلۀ بسیار کمی سطح نمونه قرار می‌گیرد و یک ولتاژ بایاس بین آن‌ها اعمال می‌شود. این ولتاژ موجب می‌شود که الکترون‌ها از فضای خلاء بین سوزن و سطح نمونه تونل بزنند و جریان الکتریکی ایجاد شود. از جریان الکتریکی ایجاد شده پروفایلی از سطح نمونه بر اساس احتمال تونل‌زنی الکترون به دست می‌آید که تابعی از فاصله، ولتاژ اعمال شده و چگالی ترازهای انرژی الکترونی موضعی (LDOS) سطح نمونه است. در این روش می‌توان ویژگی‌های نمونه در ابعاد کمتر از ۰.۱ نانومتر و عمق ۰.۰۱ نانومتر ( pm10) را مشاهده کرد.

Scanning Tunneling Microscope Operating Principle

نمونه‌های میکروسکوپ الکترونی

نمونه‌هایی که قرار است با میکروسکوپ الکترونی تصویر‌برداری شوند، باید به اندازه کافی کوچک باشند تا کاملا بر روی نگهدارنده نمونه قرار گیرند. معمولا نمونه‌ها با چسبی که از نظر الکتریکی رسانا است به نگهدارنده زیرلایه چسبانده می‌شوند تا بار الکتریکی منفی که در اثر برخورد الکترون‌ها به آنها ایجاد می‌شود، از این مسیر تخلیه شود و نمونه باعث ایجاد میدان الکتریکی که مانع از برخورد الکترون‌های بعدی می‌شود، نگردد.

در صورتی که نمونه‌ها از نظر الکتریکی نارسانا باشند یا دارای رسانایی الکتریکی کمی باشند، هنگامی که توسط پرتوی الکترونی اسکن می‌شوند، بارهای الکتریکی (مخصوصا الکترون‌های ثانویه) را جذب می‌کنند و موجب اختلال در تصویر‌برداری می‌شوند. برای تصویر برداری نمونه‌ها با میکروسکوپ الکترونی، نیاز است تا نمونه‌ها از نظر الکتریکی رسانا باشند (حداقل در سطح نمونه) و به اتصال زمین متصل شوند تا از هرگونه تجمع بار روی نمونه‌ها جلوگیری به عمل آید.

کاربردهای میکروسکوپ الکترونی

میکروسکوپ‌های الکترونی در مطالعات طیف وسیعی از نمونه‌های زیستی و مواد غیرآلی مانند میکروارگانیسم‌ها، سلول‌ها، مولکول‌های بزرگ، فلزات، بلورها و لایه‌های نازک استفاده می‌شوند.

در علوم زیستی و پزشکی از میکروسکوپ الکترونی برای مطالعه سازوکار و طبیعت مولکولی بیماری‌های استفاده می‌شود. همچنین در مشاهده ساختار سه بعدی بافت‌های زیستی یا سلول‌ها، ساختار پروتئین‌ها و مطالعه ویروس‌ها نیز کاربرد دارد.

میکروسکوپ الکترونی در صنعت نیز در حوزه کنترل کیفیت، مورد استفاده قرار می‌گیرد. همچنین در مشخصه‌یابی مواد در علوم جنایی، صنعت معدن، علوم غذایی و شیمی نفت هم کاربرد دارد.

مزایای میکروسکوپ الکترونی

• بزرگنمایی بسیار زیاد
• وضوح بسیار بالا
• فراهم آوردن امکان مطالعه در حوزه‌های وسیع‌تر

معایب میکروسکوپ الکترونی

• هزینه ساخت و نگهداری زیاد
• لزوم قرار گرفتن در محلی بدون لرزش (معمولا زیرزمین) و استفادر از سیستم‌های خنثی کننده میدان مغناطیسی
• لزوم بررسی نمونه در محیط خلاء
• نیاز به پوشش‌دهی نمونه‌های نارسانا به لایه‌نشانی با مواد رسانا مانند طلا، پالادیوم، کربن و … جهت آماده سازی نمونه‌ها برای میکروسکوپ الکترونی
• نمونه‌های حاوی آب مانند نمونه‌های زیستی باید به روش‌های مختلف پایدار شده و ضخامت آن‌ها با لایه‌برداری کم شود.

آماده سازی نمونه‌های میکروسکوپ الکترونی

در مرحله آماده سازی معمولا، روی نمونه‌های نارسانا یا دارای رسانایی کم، یک لایه بسیار نازک چند نانومتری از فلزات رسانا با استفاده از روش اسپاترینگ یا تبخیر حرارتی پوشانده می‌شود تا از تجمع بار بر روی سطح و تبخیر در اثر برخورد پرتو الکترونی پرانرژی، جلوگیری شود. موادی که غالبا نمونه‌ها با آن پوشش داده می‌شوند عبارتند از: کربن، طلا، پلاتین، آلیاژ طلا/پالادیوم، ایریدیوم و کروم.

با وجود این لایه رسانای نازک، ساختار زیر آن قابل مشاهده است مثلا شبیه یک نرده فلزی که همه جای آن رنگ خورده است ولی شکل و ابعاد آن کاملا قابل تشخیص است. در روش اسپاترینگ نمونه‌ها در محفظه خلاء، قرار می‌گیرند و سپس در حضور پلاسمای ایجاد شده از گاز آرگون، لایه‌ای چند نانومتری از ماده هدف روی نمونه ایجاد می‌شود.

از سوی دیگر، میتوان از روش تبخیر حرارتی برای لایه نشانی نمونه‌های میکروسکوپ الکترونی استفاده نمود که در این روش نمونه، داخل محفظه خلاء قرار می‌گیرد و سپس بخار ماده مورد نظر که در اثر عبور جریان الکتریکی از آن ایجاد می‌شود، به صورت لایه‌ای چند نانومتری روی نمونه را می‌پوشاند.

نمونه‌ای از تصاویر میکروسکوپ الکترونی

در ادامه چند تصویر تهیه شده توسط میکروسکوپ الکترونی نمایش داده شده‌اند:

شکل ۶. تصاویر تهیه شده توسط میکروسکوپ الکترونی از نمونه‌های مختلف، راست: گلبول‌های قرمز خون و یک لیمفوسیت، وسط: یک مورچه، چپ: سطح داخلی یک لایه پیاز

دستگاه‌های لایه نشانی و میکروسکوپ الکترونی

مدل‌هایی از دستگاه‌های ساخت شرکت پوشش های نانوساختار که قادر به انجام عمل لایه نشانی به روش اسپاترینگ هستند، گزینه‌های مناسبی برای کاربران میکروسکوپ‌های الکترونی به حساب می‌آیند. در بین محصولات شرکت پوشش های نانوساختار اسپاترکوترهای DSR1 ،DST1 ،DSCR ،DSCT و DST3 مناسب برای انجام لایه نشانی به روش اسپاترینگ هستند.

کاربران این میکروسکوپ‌ها، بسته به ماده مورد نظر (اکسید‌پذیر با اکسید‌ناپذیر) می‌توانند مدل‌های مجهز به پمپ روتاری یا مدل‌های مجهز به پمپ روتاری و پمپ توربومولکولار را تهیه نمایند. همچنین دستگاه‌های لایه‌نشانی کربن DCR و DCT شرکت پوشش‌های نانوساختار، که به ترتیب مجهز به پمپ‌های روتاری و توربو هستند، برای لایه‌نشانی کربن به عنوان کوترهای میکروسکوپ الکترونی در آماده‌سازی نمونه‌ها جهت تصویربرداری SEM و FESEM مناسب‌اند. برای لایه نشانی کربن روی نمونه‌های میکروسکوپ الکترونی، از روش تبخیر الکتریکی استفاده می‌شود. به این صورت که با عبور جریان الکتریکی نسبتا بالایی از نخ کربن یا میله کربنی، کربن در محیط خلاء بخار می‌شود و روی نمونه می‌نشیند.

به علاوه، از روش تبخیر حرارتی نیز میتوان برای آماده سازی نمونه های میکروسکوپ الکترونی بهره جست که دستگاه لایه نشانی به روش تبخیر حرارتی مدل DTT، ساخت شرکت پوشش های نانو ساختار، برای این منظور بسیار مناسب است. برای آشنایی بیشتر با دستگاه‌های لایه نشانی در خلاء شرکت پوشش های نانو ساختار به سایت آن، مراجعه نمایید.

منابع

1. https://en.wikipedia.org/wiki/Electron_microscope
2. https://www.britannica.com/technology/scanning-electron-microscope
3. https://www.nanoscience.com/techniques/scanning-electron-microscopy/
4. https://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_electron_microscope
5. https://www.unl.edu/ncmn-cfem/xzli/em/interact.htm
6. https://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_tunneling_microscopehttps://en.wikipedia.org/wiki/Transmission_electron_microscopy
7. https://en.wikipedia.org/wiki/Reflection_high-energy_electron_diffraction
8. https://photometrics.net/field-emission-scanning-electron-microscopy-fesem
9. https://www.dartmouth.edu/emlab/gallery/
10. https://en.wikipedia.org/wiki/File:Transmission_Electron_Microscope_operating_principle.ogv
11. https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/ec/Scanning_Electron_Microscope.ogv
12. https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/14/Scanning_Tunneling_Microscope.ogv